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產(chǎn)品說(shuō)明：

檢測(cè)原理

Cell Counting Kit-8簡(jiǎn)稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。

WST-8屬于MTT的升級(jí)產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

CCK-8法應(yīng)用非常廣泛，如藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)以及生物因子的活性檢測(cè)等。

CCK-8方法的優(yōu)勢(shì)

1） 表1 CCK-8法與其他細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)比較

  2）酚紅和血清對(duì)CCK-8法的檢測(cè)不會(huì)造成干擾；

  3）細(xì)胞毒性非常低，因此加入WST-8顯色后，可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀數(shù)從而找到最佳測(cè)定時(shí)間。

CCK-8試劑盒操作說(shuō)明：

一. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測(cè)定細(xì)胞具體數(shù)量）

1、先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞到培養(yǎng)板內(nèi)。

2、按比例（例如：1/2比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每個(gè)濃度建議3-6個(gè)復(fù)孔。

3、接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定OD值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X軸），OD值為縱坐標(biāo)（Y軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間。）

二. 細(xì)胞活性檢測(cè)

1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間（37℃,5% CO2）。

2、向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。

4、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

5、若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

三. 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)

1、在96孔板中配制100 μL的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)（37℃，5% CO2）。

2、向培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24或48小時(shí)）。

4、向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。

5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。

6、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

7、若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

       活力計(jì)算

     細(xì)胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100
     A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度
     A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度
     A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度
     *細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力

注意事項(xiàng)：

1） 建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。

2） 有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK-8試劑時(shí)，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基液面下加，容易產(chǎn)生氣泡，會(huì)干擾OD值讀數(shù)。

3） 白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間。

4） 當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

5） 如果沒(méi)有450 nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450 nm濾光片的檢測(cè)靈敏度最高。

6） 培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。