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特性說明：

產(chǎn)品說明：

產(chǎn)品描述：

Calcein Blue, AM本身僅呈微弱熒光(Ex/Em~322/435nm) ,具有細(xì)胞膜滲透性。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解為鈣黃綠素藍(lán)(Calcein Blue) , 探針極性增強(qiáng)并能保留在細(xì)胞內(nèi)數(shù)小時，此時熒光強(qiáng)度增強(qiáng)且熒光光譜遷移到更長波長(Ex/Em~360/445nm)， 光譜特征類似于DAPI. Hoechst 3342或Hoechst 33258。

使用說明：

一、儲存液制備

儲存液配制范圍可為1 ~ 5 mM,具體根據(jù)工作濃度來決定，建議提前配制成1000x儲存液。若使用的工作液為5μM,那么可配制5mM的儲存液，即往1mg CalceinBlue, AM (Mw: 465.41) 內(nèi)加入430μl細(xì)胞培養(yǎng)級別的DMSO  , 充分溶解，混勻。儲存液根據(jù)單次用量分裝20°C保存，避免反復(fù)凍融，數(shù)月穩(wěn)定(不要超過6個月)。

二、20% Pluronic F-127制備[可選]

稱取100mg Pluronic F-127粉末中加入500μl DMSO,配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40- 50C加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

三、染色步驟

大多數(shù)實(shí)驗(yàn)體系中Calcein Blue, AM的工作濃度為2-5μM。由于不同細(xì)胞系的最佳染色條件不同，初次實(shí)驗(yàn)建議做梯度實(shí)驗(yàn),以確定Calcein Blue, AM的最佳工作濃度，以最低的探針濃度得到最好的熒光結(jié)果為篩選原則。

1) 取一管適量分裝的儲存液(1000x) 置于室溫，至少回溫20min,低速離心后，用合適的緩沖液如PBS, HBSS-HEPES稀釋到1 x染色工作液。

[注意] :有時可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein Blue, AM儲存液內(nèi)來增強(qiáng)其水溶性。制備染色工作液前，取一管Calcein Blue, AM儲存液內(nèi)加入等體積的20% Pluronic F127,使Pluronic F127的終濃度為0.02%。加入Pluronic F127的Calcein Blue, AM溶液不可長期保存，需現(xiàn)配現(xiàn)用。

2) 對于貼壁細(xì)胞，先用胰酶EDTA或Accutase消化細(xì)胞， 離心收集細(xì)胞(1000 rpm, 3min)。對于懸浮細(xì)胞，直接離心收集細(xì)胞。 [注意] :貼壁細(xì)胞也可進(jìn)行原位染色。

3) 去上清，用PBS (或者其他緩沖液)清洗細(xì)胞2~3次，以充分去除殘留的酷酶活性。

4) 用1/10細(xì)胞培養(yǎng)基體積的Calcein Blue, AM染色工作液重懸細(xì)胞，37℃孵育20min~1h。

[注意] : 1)若細(xì)胞自身含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，需加入丙磺舒(1-2.5mM)或者苯磺唑酮(0.1-0.25mM) 到孵育體系內(nèi)以降低去酷化的Calcein Blue泄露到胞外;2)降低探針加載溫度，可能會減少探針區(qū)室化現(xiàn)象。

5) 用PBS (或者其他緩沖液)洗滌細(xì)胞兩次去除多余染料。

[注意] :如有必要，使用含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的緩中液來進(jìn)行細(xì)胞清洗。

6）用含合適濾光片(Ex/Em= 360/445nm) 的儀器進(jìn)行檢測。

注意事項(xiàng)：

1）熒光染料均存在淬滅問題，請盡星注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）乙酰氧基甲基酯(AM)易吸潮，冰箱取出后請?jiān)诟稍锏沫h(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3）Calcein Blue, AM對濕度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。 Calcein Blue, AM儲存液需要分裝避光凍存，且必須緊緊密封蓋子，干燥保存。Calcein Blue,AM工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

4）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一 次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。