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使用說明：

產品描述：

Fura-2，細胞生物學常用的一種鈣熒光探針，能特異性地結合Ca2+（結合比例為1:1），同時可發(fā)出熒光，結合Ca2+后的最大激發(fā)波長從結合前的380 nm向340 nm（Ca2+飽和時）偏移，其發(fā)射熒光強度與結合Ca2+的濃度存在定量關系。一般用340nm和380nm波長激發(fā)Fura-2，通過使用與兩種激發(fā)對應的熒光強度比率來計算細胞內的鈣離子濃度，這種比率測量方法可以消除不同細胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細胞厚度差異等一些誤差因素。Fura-2與Indo-1已成為目前使用最廣泛的比率測量的鈣熒光指示劑。目前適用于Fura 2實驗的設備有很多，但Fura-2特別適合于數(shù)字成像顯微鏡，使用該設備可更方便的調整激發(fā)波長，使探針結合鈣離子后在300-400 nm的激發(fā)波長范圍內掃描                                Fura-2的吸收偏移，在510 nm處檢測發(fā)射波長。

由于Fura-2是極性大的酸性化合物，無法進入細胞內，為此在其負性基團上結合乙酰氧甲酯，使其成為Fura-2/AM，該變化既增加了酯溶性又消除了負電荷，極大的提高了細胞滲透性。在細胞內，F(xiàn)ura-2/AM被酯酶水解成Fura-2后可與胞漿游離Ca2+可逆性結合。

操作說明：

一、需要試劑準備

1）（可選）配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127粉末（Cat No. 60318ES60）中加入0.5 mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30 min。溶液室溫保存，不要冷藏。如果有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2）Hanks?balanced salt solution

二. 使用步驟

 1）Fura-2/AM儲存液的配制

利用高質量無水DMSO溶解Fura-2/AM配制成1-5 mM的儲存液，該儲存液可分裝于-20℃避光干燥密封保存。每次使用前需回溫至室溫。

【注】：① 因為Fura-2/AM在水中的溶解性和穩(wěn)定性較差，不可用水溶性緩沖液配制Fura-2/AM儲存液。

② 溶解用的DMSO需要保證新鮮無水，否則將會導致AM 體水解，使熒光染料無法進入細胞，影響實驗效果。

2）Fura-2/AM工作液的配制

利用合適緩沖液將Fura-2/AM稀釋成1-5 μM的工作液，具體稀釋方法如1 mM母液配制1 mL濃度為4 μM工作液，用1 mL 緩沖液稀釋4 μL 1 mM母液即可，混勻。

【注】：① 典型工作液濃度為0.1-5 μM，具體的使用濃度需根據實驗要求進行優(yōu)化。為了避免過度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

② Fura-2/AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復凍存。

3）（可選）如果Fura-2/AM進入細胞的效果不好，可向Fura-2/AM/DMSO 溶液中加入適量20% Pluronic F127溶液，最終稀釋至其終濃度為0.04-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Fura-2/AM在緩沖液中聚合并能幫助其進入細胞。

【注】：Pluronic F127可降低Fura-2/AM的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議將其加入儲存液長期保存。

4）取出預培養(yǎng)的細胞，除去培養(yǎng)基，使用緩沖液洗滌細胞3次。

【注】：如果使用含血清的培養(yǎng)基，血清中的酯酶會分解 AM 體，從而降低Fura-2/AM進入細胞的效果。另外含有酚紅的培養(yǎng)基會使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養(yǎng)基殘留。

5）將Fura-2/AM工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。在37℃培養(yǎng)15-60 min，然后除去Fura-2/AM工作液。

【注】：關于孵育的時間，如果首次做實驗不能確定，建議先孵育30 min，看熒光效果：如果細胞死亡較多，適當縮短時間；如果熒光強度太弱，適當延長時間。

6）用緩沖液洗滌細胞 3 次，以充分去除殘留的Fura-2/AM工作液。然后加入緩沖液覆蓋細胞。

7）37℃培養(yǎng)箱孵育約 20-30 min，以確保 AM 體在細胞內的完全去酯化作用。

8）數(shù)字成像顯微鏡檢測細胞。

【注】：①某些細胞會將熒光探針被動運輸或分泌到胞外，在一些通過陰離子泵泄漏探針的細胞內該現(xiàn)象尤其嚴重，此時需加入一些抑制劑防止該情況的發(fā)生，如加入適量的丙磺舒或磺吡酮。但需注意，抑制劑的加入量必須經過優(yōu)化，過量的抑制劑也會對細胞造成不利影響。

②某些細胞具有自體熒光會影響結果分析，需使用未加載探針細胞做對照，在結果分析時在同一波長下扣除自熒光。

注意事項：

為了您的安全和健康，請穿實驗服并帶一次性手套操作。

本產品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應用或其他用途。