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產(chǎn)品說明：

使用說明：

產(chǎn)品描述：

BrdU是一種合成的胸苷溴化類似物，在S期可替代胸苷選擇性插入細胞DNA。BrdU通常和廣泛用于測定DNA合成和標記分裂細胞，最后用來研究誘導(dǎo)細胞增殖的信號通路和其他生理過程。BrdU通過體外細胞培養(yǎng)或體內(nèi)注射的方式進行探針加載，然后用抗BrdU的抗體進行特異性檢測。

BrdU標記后，對組織或細胞進行固定和透化后，需要額外的DNA水解步驟(有時也稱DNA變性)，從而允許抗BrdU的抗體能夠與插入DNA的BrdU結(jié)合。BrdU抗體能夠與其他細胞標記物如Ki67,雙皮質(zhì)素(DCX)和NeuN聯(lián)合使用來鑒定增殖細胞和新分化神經(jīng)元。

操作步驟:

Brdu儲存液的準備用1 X DPBS充分溶解適量的Brdu配置10 mg/mL的母液，過濾除菌后，按照0.5mL/管的量分裝放在-20°C或者-80°C長期保存，避免反復(fù)凍融。Brdu儲存液再融化后，4°C可穩(wěn)定存放一周。
1.  體內(nèi)Brdu標記

1）腹腔注射法（常用）：無菌的10 mg/mL（溶于DPBS）適合用于體內(nèi)注射用。按照100-200 μL（1-2 mg） Brdu的量腹腔注射到小鼠體內(nèi)。注意：最短在注射后0.5 h后在小腸，胸腺和骨髓瘤處就能檢測到Brdu。而一般在注射后24 h內(nèi)幾乎所有組織都能檢測到Brdu。這個時間可能對于一些快速分化的組織如小腸來說有些久。

2）根據(jù)自身的實驗體系，在合適的時間點處死動物，摘除待研究的組織。使用冰凍切片或者石蠟包埋的方法進行組織處理和切片制備。然后進入后續(xù)的IHC染色步驟。

2. 體外Brdu標記（培養(yǎng)原代細胞或者細胞系）

注：總的來說，10 μM Brdu（稀釋于培養(yǎng)液）是一個比較合適的方法用來標記不同物種來源的原代細胞或細胞系。當然，建議針對具體的實驗體系優(yōu)化方法。

1）在96孔板上按標準步驟進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)時間一般為1-72 h；

2）Brdu工作液的準備：用組織細胞培養(yǎng)液按照1:30的比例稀釋儲存液得到1mM Brdu工作液。然后取10 μL 1 mM Brdu溶液直接加入1 mL組織培養(yǎng)液即得到最終工作液。37°C溫?zé)帷?/span>

3）按100 μL/孔Brdu工作液的量進行細胞標記，37°C孵育60 min~過夜。同時設(shè)置非Brdu標記的細胞作為陰性對照。注意：最佳的孵育時間取決于細胞增殖速度以及需要達到的實驗?zāi)康?。比如，對于快速增殖細胞（如HL-60）有效孵育時間為30-45 min；對于原代細胞（如未受外源刺激培養(yǎng)的外周血淋巴細胞）孵育時間可能需要24 h。細胞密度最好不要超過2x106 cells/mL。

4）制備單細胞層玻片，使用以下任何一種方法：

a. 細胞離心涂片（cytospin）制備：使用細胞離心涂片機，將100 μL標記好的細胞（濃度為：1-2 x106 cells/mL）直接離心到干凈，無脂肪，poly-L-lysin包被的玻片上，風(fēng)干。

b. 細胞涂片（cell-smear）制備：取一小滴標記好的細胞懸液于干凈，無脂肪，poly-L-lysin包被玻片的一端，然后用第二個干凈玻片將其均勻涂布成一薄層。室溫風(fēng)干。

5）將玻片置于70%冰乙醇放在-20°C下固定20-30 min。

6）PBS清洗細胞3次，每次5 min。

7）加入1.5M HCl中室溫孵育30 min。注意：DNA的變性對于Brdu染色的成功至關(guān)重要。

8）吸去HCl，PBS清洗2次，每次5 min。

9）進入后續(xù)ICC染色步驟。

3. 體外Brdu標記（組織薄片）

1）Brdu工作液的準備：用組織細胞培養(yǎng)液按照1:30的比例稀釋儲存液得到1 mM Brdu工作液。然后取10 -20 μL 1 mM Brdu溶液直接加入1 mL組織培養(yǎng)液即得到最終工作液。確保有足夠的工作液（37°C溫?zé)幔┩耆萁M織。

2）用手術(shù)刀或者鋒利的刀片將組織切割成約1 mm厚，2 mm2大小的薄片。建議在溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基內(nèi)進行切片，利于維持組織的活力。

3）轉(zhuǎn)移組織薄片至預(yù)裝有10 mL Brdu標記液的15 mL離心管內(nèi)。于37°，CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育需要的時間。孵育時間可變，取決于組織薄片類型以及需要達到的實驗?zāi)康模ǔＳ玫臑?-4 h）。直接丟棄未用完的標記液。

4）37°C PBS清洗組織薄片，每次5 min。

5）使用標準的冰凍切片或者石蠟包埋切片的方法固定組織。

注意事項：

該品對肌體有不可逆損傷的可能性。使用時應(yīng)穿防護服和戴手套。應(yīng)避免吸入本品的粉塵。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。