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特性說(shuō)明：

產(chǎn)品描述：

胰蛋白酶(胰酶，Trypsin)，CAS: 9002-07-7. 來(lái)源于胰腺的一種絲氨酸蛋白酶，由223個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽，底物特異性是帶正電荷的賴(lài)氨酸和精氨酸側(cè)鏈。胰酶主要切割賴(lài)氨酸和精氨酸羧基端，當(dāng)兩者之一緊隨為脯氨酸的情況除外。 另外，當(dāng)切割位點(diǎn)任一邊緊鄰酸性殘基， 胰酶水解速率也會(huì)減緩。

胰蛋白酶(胰酶，Trypsin)。以無(wú)活性的胰蛋白酶原(Trypsinogen) 形式分泌于胰腺中，通過(guò)切割其末端六肽而得到活化，產(chǎn)生天然單鏈形式的β-胰酶(β-Trypsin)，隨后進(jìn)行有限的自發(fā)裂解產(chǎn)生具水解活性的α-Trypsin (由二硫鍵共價(jià)連接的二條肽鏈組成)。胰酶水解活性可被多種化合物所抑制，有1)來(lái)源于胰腺、大豆、青豆、蛋清的天然胰蛋白酶抑制劑; 2)銀離子; 3)有機(jī)磷化合物，如氟磷酸異丙酯DFP; 4)特定蛋白酶抑制劑，如AEBSF、抗蛋白酶、 抑肽酶、PMSF、TLCK等;

本品是來(lái)源于豬胰腺的胰蛋白酶凍干粉，經(jīng)γ射線處理滅活病毒,經(jīng)過(guò)豬細(xì)小病毒和支原體檢測(cè)?；跇?biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法的酶活力為250 units/mg，即1:250。 廣泛用于細(xì)胞傳代，對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行消化以制備單細(xì)胞懸液，常用的工作濃度是0.025-0.5% (w/v) 。也可聯(lián)合其他蛋白酶如膠原酶、彈性蛋白酶一起使用， 以消化組織。

使用方法：

1.胰酶儲(chǔ)存液(2.5%，w/v) 的配制

1.1稱(chēng)取2.5g胰酶粉末溶于100mI不含鈣鎂的平衡鹽緩沖液，如HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)。并調(diào)整pH在7.4-7.6.此時(shí)得到的即2.5%胰酶儲(chǔ)存液，置于4°C短時(shí)間保存，3個(gè)月相對(duì)穩(wěn)定。建議分裝凍存，利于長(zhǎng)期保存。解凍后可能會(huì)出現(xiàn)少量沉淀，屬于正?，F(xiàn)象，不會(huì)影響使用效力。

1.2細(xì)胞的消化可以直接用胰酶溶液，但常使用胰酶-EDTA溶液，因?yàn)镋DTA是一種II價(jià)金屬離子螯合劑，能夠螫合鈣鎂離子，減少細(xì)胞間的粘附性，從而增強(qiáng)胰酶活性。

[注①] :胰酶用于細(xì)胞傳代的工作濃度范圍為0.025%-0.5%，具體濃度的選擇主要受胰酶活性、孵育時(shí)間和細(xì)胞系類(lèi)型幾個(gè)方面影響。若用過(guò)高濃度消化過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而殺死細(xì)胞。當(dāng)對(duì)使用濃度把握不大，建議先使用低濃度消化，慢慢的摸索出合適的工作濃度。

[注②] :胰酶-EDTA溶液的配制(僅作參考，根據(jù)需要的實(shí)際胰酶濃度來(lái)調(diào)整)

無(wú)Ca2+. Mg2+及酚紅的平衡鹽溶液485ml

胰酶儲(chǔ)存液(2.5%， w/v)     10 ml

EDTA溶液(2%，w/v)        5ml

2.貼壁細(xì)胞消化(培養(yǎng)板)

2.1吸掉培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液，用不含Ca2+/Mg2+的緩沖液清洗單層貼壁細(xì)胞，直至清除殘余血清,吸掉鹽溶液。

2.2向上述貼壁細(xì)胞中加入適量胰酶溶液或者胰酶-EDTA溶液，完全覆蓋細(xì)胞即可。此時(shí)將細(xì)胞置于37°C培養(yǎng)箱孵育2min左右

2.3立即取出，傾斜培養(yǎng)板，吸掉胰酶或者胰酶-EDTA溶液，輕拍培養(yǎng)板，觀察細(xì)胞的消化狀態(tài)。若消化不夠，可放回37℃培養(yǎng)箱短時(shí)孵育，直至細(xì)胞從表面脫落。整個(gè)消化過(guò)程可通過(guò)倒置顯微鏡來(lái)觀察。

[注①] :消化時(shí)間跟細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞密度、培養(yǎng)液內(nèi)血清濃度、胰酶活性、以及消化前細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間等因素有關(guān)。胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷以及消化時(shí)間盡量保持在最低水平。

2.4加入含血清的適量培養(yǎng)液到消化好的細(xì)胞內(nèi)，輕輕反復(fù)吹吸從而將細(xì)胞從培養(yǎng)板底盡可能吹離,以及吹散細(xì)胞團(tuán)，吹洗時(shí)盡量避免氣泡的產(chǎn)生。

[注①] :血清能抑制進(jìn)一步的胰酶消化， 保護(hù)細(xì)胞不被過(guò)度消化。當(dāng)使用無(wú)血清培養(yǎng)液，建議此時(shí)加入等摩爾的大豆胰酶抑制劑(Soybean trypsin inhibitor) 以起到相同效果。

2.5進(jìn)行下一步操作[亞培養(yǎng),或細(xì)胞計(jì)數(shù)]或細(xì)胞凍存。

[注①] :操作時(shí)務(wù)必小心謹(jǐn)慎，同時(shí)時(shí)刻注意避免交叉污染發(fā)生的可能性。

注意事項(xiàng)

1)胰蛋白凍干粉產(chǎn)品常遇到的活性定義及其轉(zhuǎn)換,

1 BAEE Unit:在25℃, pH 7.6的條件下，以BAEE為底物，3.2 ml的反應(yīng)體系中，A253吸光值每分鐘會(huì)發(fā)生0.001的變化即為一個(gè)酶活單位。

1 TAME Unit:在25%C，pH 8.2，0.001M Ca2+條件下，每分鐘水解1μmol p-toluenesulfonyl-L-arginine methyl ester (TAME)的用量。

1 USP Unit: 在指定條件下，每分鐘引起吸光值發(fā)生0.003的變化的樣品活性。

1 TAME unit = 19.2 USP or NF units = 57.5 BAEE Unit

2)為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并裁-次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。