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什么是二抗?
二抗是在其它宿主體內(nèi)制備的能與一抗或一抗片段結(jié)合的抗體,上面通常連有酶或熒光素等標(biāo)簽。由于二抗所具備的優(yōu)點(diǎn)使得其在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中得以應(yīng)用廣泛,如western blot(通過與特異性抗體結(jié)合來(lái)鑒定蛋白質(zhì)),ELISA(以耦聯(lián)有酶的抗體或抗原為標(biāo)記來(lái)檢測(cè)特異性的蛋白質(zhì),尤其是相應(yīng)的抗原或抗體),免疫組織化學(xué)(檢測(cè)組織中的特異性抗原),免疫細(xì)胞化學(xué)(通過免疫學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞的抗原組成),流式細(xì)胞術(shù)(通過檢測(cè)激光所激發(fā)熒光來(lái)鑒定分離不同類型的細(xì)胞)及免疫沉淀(通過抗原與抗體的特異性結(jié)合作用來(lái)分離相應(yīng)抗原)。
使用二抗的優(yōu)勢(shì)?
二抗針對(duì)某一特定物種(如小鼠)的所有抗體均具有特異性,因而使用標(biāo)記的二抗可以免去對(duì)每一個(gè)一抗進(jìn)行標(biāo)記,大大節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用;此外,一個(gè)一抗分子可以同時(shí)結(jié)合幾個(gè)二抗分子,從而使信號(hào)大大增強(qiáng),提高了實(shí)驗(yàn)靈敏度。二抗可以耦聯(lián)有幾種不同的標(biāo)記,可以是酶,熒光素,或生物素。
如何選擇二抗?
檢測(cè)任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇,同時(shí)在后繼試驗(yàn)中也會(huì)有不同的檢測(cè)方案,因此在選擇二抗的時(shí)候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測(cè)方案的要求,其中如何根據(jù)一抗的種屬來(lái)源和類型選擇二抗尤為重要。小編根據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn)整理了一下選擇的要點(diǎn):
1. 一抗的種屬來(lái)源
二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來(lái)源,例如:如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體,二抗則選抗小鼠的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可);如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體,則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據(jù)一抗的物種來(lái)源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。
2. 一抗是屬于哪個(gè)類或亞類
除了要與一抗的種屬來(lái)源相一致,二抗還需與一抗的類別或亞類相匹配,這通常是針對(duì)單克隆抗體而言。一般來(lái)說多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白,因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。而單克隆抗體則相對(duì)復(fù)雜些,由于單克隆抗體有不同的類別和亞型,因此相應(yīng)的二抗也需要根據(jù)這些亞型進(jìn)行選擇。
單克隆抗體的類別及亞類通常會(huì)在產(chǎn)品說明書中都會(huì)有描述,如果您的一抗是小鼠IgM,那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgG抗體。如果單克隆一抗是小鼠 IgG的某一亞類(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合,或者您也可以選擇專門針對(duì)這一亞類的二抗,例如,如果您的一抗是小鼠IgG1,那么您可以選擇抗IgG1的二抗,此種抗體在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中尤其適合。在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下,可以選用抗相應(yīng)物種IgG,因?yàn)榇朔N抗體可以識(shí)別大多數(shù)類型的IgG免疫球蛋白。
3. 二抗的種屬來(lái)源
一般來(lái)說,不同的種屬來(lái)源與二抗的質(zhì)量沒有必然的聯(lián)系,來(lái)源于山羊的二抗與來(lái)源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里,如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里,如果其中一個(gè)一抗是山羊來(lái)源的,一個(gè)是小鼠來(lái)源的,則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗,這時(shí)候,二抗就不能選擇山羊或者小鼠來(lái)源的。選擇相應(yīng)的驢來(lái)源的二抗,就非常適合做類似雙標(biāo)的免疫實(shí)驗(yàn)。雙標(biāo)得2個(gè)都抗才行,故選擇第3個(gè)種源的抗體
4. 選擇哪種形式的二抗,是整個(gè)IgG分子,F(ab')2片段,還是Fab片段?
整個(gè)IgG分子:此種抗體適用于多數(shù)情況。
F(ab')2片段:該種抗體是由兩個(gè)靠二硫鍵連接的用于結(jié)合抗原的Fab片段組成, 這些抗體用在特定的情況中,如需要避免抗體與具有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合的情況。
Fab片段:它們只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn),一般用來(lái)封閉內(nèi)源性免疫球蛋白。
5. 二抗的耦聯(lián)標(biāo)記
一般來(lái)講,耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶,熒光基團(tuán)(FITC, RRX, TR, PE)和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于western blot和ELISA,最常用的二抗是酶標(biāo)二抗,而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞免疫化學(xué),組織免疫化學(xué),流式細(xì)胞術(shù))中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗,免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測(cè)信號(hào),可以使用biotin/avidin檢測(cè)系統(tǒng)。在一些熒光檢測(cè)方案中,則需要選擇不同的熒光標(biāo)記;而金顆粒標(biāo)記的二抗則更多的應(yīng)用于免疫電鏡中。
6. 抗體的純度
親和層析純化的抗體一般更受人們歡迎,因?yàn)檫@些產(chǎn)品的純度最高,產(chǎn)生的非特異性背景最少。但是有些情況下也要考慮到純化過程中損失的IgG部分,因?yàn)槠渲泻杏H和力很高的抗體,尤其是當(dāng)目的抗原存在的量很小的時(shí)候,高親和性的IgG部分就顯得尤為重要。
下面總結(jié)了幾種具有不同特異性的二抗
1)針對(duì)整個(gè)抗體分子(H+L)具有特異性:
如anti-IgG(H+L),此類抗體既可以與抗體的重鏈結(jié)合也可以與輕鏈結(jié)合,即與抗體分子的Fc,F(ab')2/Fab部分均可反應(yīng),anti- IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應(yīng)(如IgM和IgA),因?yàn)樗械拿庖咔虻鞍锥季哂邢嗤妮p鏈(κ鏈或λ鏈)。
2)針對(duì)Fab片段具有特異性:
這類抗體與重鏈輕鏈均可以結(jié)合,由于它們可以與輕鏈反應(yīng),它們同時(shí)也可以和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反應(yīng)。
3)針對(duì)Fc片段或重鏈具有特異性:
這類抗體和重鏈的Fc部分反應(yīng),因此它們是類別特異性的。即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應(yīng),mu鏈特異性抗體只識(shí)別IgM,依此類推。
4)輕鏈(lambda,kappa)特異性:
與所有類別的抗體反應(yīng),因?yàn)樗蓄悇e的抗體均具有相同的lambda鏈或kappa鏈。
5)經(jīng)過吸附處理的二抗:
不同來(lái)源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu),抗一個(gè)物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng),因此有些二抗經(jīng)過了動(dòng)物或人類IgG吸附處理,以減少非特異性背景。 例如,如果是小鼠的組織或細(xì)胞,那么選擇經(jīng)小鼠血清或IgG吸附處理過的二抗可以減少非特異性結(jié)合。但是此種抗體識(shí)別表位的數(shù)量被大大減少。
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